紀念館共收藏國家珍貴文物6000余件，其中一級文物300余件，藏品的來源包括出土挖掘、民間征集、社會捐贈等。 館藏文物中最具代表性的藏品有：中山碼頭集體屠殺遺址出土的南京大屠殺遇難者遺物，美國牧師約翰·馬吉拍攝南京大屠殺暴行時使用的攝像機及膠片，南京國防部審判日本戰(zhàn)犯軍事法庭庭長石美瑜保存的戰(zhàn)犯谷壽夫、向井敏明等人的死刑判決書底稿，中國遠征軍抗戰(zhàn)老兵梅樹淇1942年的戰(zhàn)地日記，以及分館南京利濟巷慰安所舊址陳列館中陳列的南京福安里慰安所舊址發(fā)現(xiàn)的日軍對“慰安婦”使用的婦科檢查用具等。
